Termociclador: ¿Cómo se trabaja?

noviembre 3, 2021by Kalstein
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Un termociclador o también llamado secuenciador térmico es un equipo de laboratorio, que permite llevar a cabo la amplificación de las moléculas de ADN mediante la técnica de PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa), a través de cambios cíclicos de temperaturas que generan a su vez la amplificación de hebras de este acido nucleico. Este equipo se emplea para amplificaciones cualitativas o inclusive para cuantificar la cantidad de ADN amplificado.

La técnica de PCR ocurre bajo un proceso que es automático y puede finalizarse en tan sólo unas pocas horas. Este proceso es dirigido por completo por el termociclador, quien está programado para cambiar la temperatura de reacción cada pocos minutos haciendo posible la desnaturalización y síntesis de ADN.

Esta técnica se puede dividir en dos grandes categorías:

  • La PCR para la amplificación e un solo sitio conocido del genoma (locus): En este tipo de PCR se necesita conocer la secuencia que se trabaja, y a través de ella es posible hacer filogenias.
  • La PCR en la que no es necesario conocer la región que se está amplificando (se amplifican regiones no conocidas, como zonas hipervariables del genoma), por lo cual no se sabe el tamaño de los fragmentos que se esperan. Se utiliza para determinar el polimorfismo genético.

¿Cómo está constituido un termociclador?

Un termociclador consiste generalmente en un bloque de resistencia eléctrica que distribuye a través de una placa una temperatura homogénea (entre 4ºC y 96ºC) durante un tiempo programable. En algunos equipos la resistencia eléctrica se ha sustituído por la tecnología Peltier (semiconductores), que permite mayor homogeneidad en la temperatura.

Debes tener en cuenta que el termociclador empleado en la PCR de punto final no es el mismo empleado para una PCR de tiempo real, debido a que este último debe detectar fluorescencia y en diferentes canales de absorción.

Funcionamiento de un termociclador

El funcionamiento de un termociclador se basa en la realización de tres importantes pasos durante la técnica de PCR. El primer paso es la desnaturalización, la cual ocurre en el primer ciclo. De allí parte a los siguientes ciclos para separar hebras formadas. Mientras esto ocurre la temperatura oscila entre los 94 y 98 º C. este proceso dura al menos unos 10 segundos. Recordemos que la estructura del ADN es bicatenaria, por lo que, a través de este paso, se obtiene la separación de la doble cadena, en cadenas separadas.

El segundo paso consiste en la alineación de los cebadores en la hebra del molde que se quiere amplificar. Este paso tiene una duración aproximada de unos 20 segundos y aquí el termociclador ajusta la temperatura entre 40°C y 60°C, a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrogeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y las uniones más estables duraran más tiempo, quedando los cebadores alineados formando así una pequeña región de doble cadena. Esto ocurre porque la misma depende más que todo de los primers usados en esta operación.

El tercer paso es la elongación de la doble hebra de 20 pares la cual ha sido creada en el paso anterior, a través de la unión de la polimerasa quien comienza a copiar en sentido 5´ a 3´, agregando unas bases más, y formándose puentes de hidrogeno entre las bases. Alcanzándose en este paso una temperatura de 72 °C, que la temperatura optima o de mayor actividad de la polimerasa, quien continua la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los cebadores alineados.

Luego de este paso es muy probable que se vuelva al primero de 98 º C durante unos 10 segundos y luego repetir el ciclo entre unas 30 y 45 veces más. Luego de estos 3 pasos se añade un paso más de calor, al menos unos 72 grados durante al menos 7 minutos. Esto es necesario para poder desanidar las hebras del ADN de los cebadores y la polimerasa. Posteriormente ocurre una disminución de temperatura de 15 y 4 º C para así mantener la muestra en perfecto estado hasta el momento en el que se necesite.

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